آب مقطر
ــــ
ــــ
۳-۳ تکنیک ها
۳-۳-۱ تکنیک PCR
پس ازتخلیص نمونه ها و به دست آوردن DNA ژنومی، لازم است بخشی از این DNA ژنومی که حاوی قطعه مورد نظر استف تکثیر گردد.بدین جهت از تکنیک PCRاستفاده گردیده واکنش PCR یک تکنیک برگرفته از همانند سازیDNA در داخل سلول است که شامل سه مرحله است.
۱) مرحله ی جداسازی[۲۴]
۲) مرحله اتصال پرایمرها[۲۵]
۳) مرحله ی تکثیرDNA [۲۶]هدف توسط فعالیت آنزیم پلی مراز
دناتوراسیون یا واسرشت شدن( Denaturation):
انجام پلیمریزاسیون DNA، مستلزم جدا شدن دو رشته دایمر آن از هم است.وجود آنزیم های توپوایزومراز و هلیکاز به همراه ترکیبات پروتئینی در شرایط طبیعی واکنش جداسازی دو رشته DNAرا از هم کاتالیز می کنند.درجه حرارت ۹۴ تا ۱۰۰ درجه سانتیگراد مورد استفاده در واکنش PCR جایگزین استفاده از این آنزیم ها و ترکیبات پروتئینی نیازمند انرژی گردیده که هزینه کمتری را برای جداسازی رشته های DNA از هم به سیستم تحمیل می کند.
اتصال پرایمرها (Annealing)
کاهش دمای محیط به میزان حدوداً ۱ تا ۵ درجه پایین تر از Tm پرایمرهای مورد استفاده؛ به گونه ای که دما نه به قدری بالا باشد که پرایمرها به الگو متصل نشوند و نه به اندازه ای پایین باشد که اتصال غیراختصاصی پرایمر به مناطق دیگر ژنوم هم پایدار گردد، دراین مرحله موجب اتصال اختصاصی پرایمر به الگو می شود.از آنجایی که اتصال اختصاصی پرایمر به الگو در طی واکنش لازمه دستیابی به محصول اختصاصی است، تعیین دقیق درجه حرارت و طول زمان این مرحله از اهمیت بالایی برخوردار خواهد بود.همانطور که اشاره شد درجه حرارت مطلوب این مرحله برای اتصال تدریجی پرایمر-الگومعمولاً ۱ تا ۲ درجه سانتیگراد پایینتر از Tm پرایمرهای به کار رفته است زیرا چنین درجه حرارتی علاوه بر اینکه به اندازه ای پایین است که امکان تشکیل دورگهای صحیح بین الگو- آغازگر را بدهد به قدری بالاست که امکان پایدار شدن یک دورگ غیر اختصاصی الگو-پرایمر، را هم فراهم نمی کند.بنابراین دوراز ذهن نیست که هر دو پرایمر طراحی شده در یک واکنش PCR باید حتی المقدور Tm مشابهی داشته باشند تا دمای اتصال تدریجی () بهینه یکی پایین تر یا بالاتر از دمای اتصال تدریجی جفتش نباشد.
را میتوان به طور تجربی تعیین کرد، اما روش متداول تعیین آن استفاده از فرمول ریاضی زیر است که معمولاً در مورد الیگونوکلئوتیدهایی با طول بیش از ۱۳ نوکلئوتید به کار میرود:
Tm= 64.9 +41.(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
y، z، w، و x در این فرمول به ترتیب نمایانگر تعداد نوکلئوتیدهای G، C، A و T در توالی آغازگر می باشند.
گسترش (Extention):
دمای مناسب در این مرحله معمولاً همان دمای بهینه برای فعالیت Taq پلیمراز؛ یا همان ۷۲ است. فاکتورتعیین کننده در موفقیت این مرحله انتخاب زمان است که با توجه به طول لوکوس مورد نظر از ۱ تا ۲ دقیقه متغیر خواهد بود. همانطور که قبلاً ذکر شد ۲۵ الی۳۰ بار تکرار چرخشی این سه مرحله در نهایت موجب دستیابی به میلیون ها کپی از لوکوس مد نظر می گردد که می تواند در ارزیابی ها و واکنش های ملکولی تکمیلی بعدی مورد استفاده قرار گیرد.
۳-۳-۲ بهینه سازی PCR
بهینه سازی یعنی تعیین غلظت های مناسب مواد واکنشگر، و دمای مناسب اتصال پرایمرها جهت به دست آوردن محصولPCR مناسب. برای این منظور می توان برای هر یک از پارامترها مثل یون منیزیوم، TM، میزان آنزیم، میزانDNA الگو چندین غلظت مختلف به کاربرد، سپس با بررسی محصول PCR بهترین غلظت را انتخاب کرد. البتهPCR باید از نظر دمای اتصال پرایمرها، همچنین زمان هر یک از مراحل PCR نیز بهینه سازی شود.
۳-۳-۳ تعیین ژنو تیپ افراد
در این تحقیق پلی مورفیسم تک نوکلئوئیدی V600E ابتدا توسطTetra primer ARMS PCR بررسی و سپس صحت نتایج به دست آمده با تکنیک ARMS PCRتأیید گردید.
۳-۳-۳-۱ تعیین ژنوتیپ افراد با بهره گرفتن از تکنیک
System Polymerase Chain Reaction Tetra Primer Amplification Refractory Mutation
روش Tetra primer Arms PCR به دلیل عدم استفاده از آنزیم یکی از روش های ارزان و سریع برای تعیین ژنوتیپ افراد است. شکل ۳-۱ طرح شماتیک این تکنیک را نشان می دهد.
شکل ۳ـ۱: طرح شماتیک Tetra primer ARMS PCR (115)
۳-۳-۳-۱-۱ طراحی پرایمرها Tetra primer ARMS PCR برای پلی مورفیسم rs113488022 ژن BRAF
اولین قدم در انجام PCR طراحی پرایمر است.برای طراحی پرایمر ابتدا باید توالی قطعه ی مورد هدف تکثیر را از بانک های اطلاعاتی به دست آورد.چون توالی مورد نظر قطعه ای از ژن کد کننده است توالی آن را از NCBI به دست می آوریم.جهت انجام تکنیک Tetra primer Arms PCR طراحی پرایمر از اهمیت زیادی برخوردار است .در این تکنیک دو پرایمر در یک سوی پلی مورفیسم و دو پرایمر بعدی در دو سوی دیگر پلی مورفیسم طراحی می شود ،به گونه ای که پرایمرهای درونی همراه با پرایمرهای بیرونی، بسته به نوع پلی مورفیسم محصولاتی با طول متمایز داشته باشند، همچنین دو پرایم بیرونی با همکاری هم محصولی بزرگتر می سازند که کنترل مثبت صحت عملکرد PCR می باشد (شکل۳-۲).در این تکنیک باایجاد Mismatch درسر پرایمرهای درونی آنها اختصاصی تر می گردد.پس از طراحی پرایمر آنالیز آن ها توسط نرم افزار Oligo ویرایش ۷ و NCBI جهت اطمینان از ویژگی بالا، عدم تکمیل ساختاهای ثانویه و از هم مهمتر اختصاصیت برای مکان مورد نظر انجام پذیرفت.در این تکنیک باید طراحی پرایمرها به گونه ای باشد که قطعات حاصل بر روی ژل آگارز قابل تفکیک باشند. همچنین بایستی دمای ذوب ۴ پرایمر به همدیگر نزدیک باشند.
شکل ۳ـ۲:محل اتصال پرایمرهای تکنیک Tetra primer ArmsPCR به ژن BRAF در محل پلی مورفیسم V600E: محل جهش، محل اتصال پرایمرها ونیز محل ایجاد Mismatch مشخص شده است. Fo پرایمر رفت بیرونی،RI پرایمر برگشت درونی، FIپرایمر رفت درونی، RO پرایمر برگشت بیرونی را مشخص می کند. توالی از بانک اطلاعاتی NCBI به دست آمده است.
جدول ۳ـ۳: پرایمرهای طراحی شده جهت تعیین ژنوتیپ افراد در V600E توسط تکنیک Tetra primer ARMS PCR ( محلMismatch در پرایمرهای درونی مشخص شده است)
AGGTGATTTTGGTCTAGCTACTGT
Forward inner
GACCCACTCCATCGAGATTACT
