Actin R

CAAACACTGTACTTTCTCTCCG-3′ 5′-

۳-۷- استخراج دی‏ان‏ا از نمونه‌ی‌ گیاهی با بهره گرفتن از روش CTAB^[16] تغییریافته‌
۳-۷-۱-تهیه‌ی محلول استخراج
برای تهیه‌ی محلول استخراج به میزان ۲۲۰ میلی‌لیتر، کلیه‌ی مواد جدول ۳-۴ در یک بشر ریخته شده و برای مدت کمتر از یک دقیقه در مایکروویو^[۱۷] قرار داده شدند پس از رسیدن دما به ۷۰ درجه سانتیگراد، به میزان ٢/٢ گرم، هگزا دسیل تری متیل آمونیوم بروماید^[۱۸] به آن اضافه و کاملا حل شد سپس بشر برای چند دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا سرد شود سپس ٢/٢ میلی‌لیتر مرکاپتواتانول باکتریایی^[۱۹] به آن اضافه شد و در دمای اتاق نگهداری شد.

جدول ۳-۴- تهیه‌ی محلول استخراج دی‌ان‌ا.

میزان مورد نیاز

مواد

۱۴۳ میلی‌لیتر

آب دِیونیزه

۲۲ میلی‌لیتر

تریس ۱ مولار ۵/۷ pH

۲۲ میلی‌لیتر

pH 5/0 مولار ۸ EDTA

۸/۳۰ میلی‌لیتر

کلرید سدیم ۵ مولار

۳-۷-۲- روش کار
۱- برگ‏های تازه برداشت شده در نیتروژن مایع منجمد و تا زمان استفاده در ۸٠- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
۲- حدود ml ۴٠٠ برگ‏ منجمد شده با نیتروژن مایع ساییده شد.
۳- بافت گیاهی پودر شده‌‌‌ی منجمد از هاون چینی به لوله‌ی ml 50 (روی یخ) انتقال داده شد.
۴- میزان ml 9 بافر استخراج ° C65 به آن اضافه و لوله در دمای ۶۵ درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت تکان داده شد.
۵- لوله‌ها به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند.
۶- به نسبت ۱‌:‌۲۴ به هر لوله اکتانول:کلروفرم اضافه شد.
۷- لوله‌ها در دمای اتاق به مدت ۱۰ دقیقه تکان داده شدند.
۸- لوله‌‌ها با سرعتg 1420 به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شدند.
۹- با بهره گرفتن از میکروپیپت محلول رویی به یک لوله‌ی جدید ml 15 منتقل شد.
۱۰- اکتانول:کلروفرم به نسبت ۱‌:‌۲۴ به هر لوله اضافه شد.
۱۱- لوله‌ها در دمای اتاق به مدت ۱۰ دقیقه تکان داده شدند.
۱۲- لوله‌ها با سرعتg 1420 به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شدند.
۱۳- با بهره گرفتن از میکروپیپت محلول رویی به یک لوله‌ی جدید ml 50 منتقل شد.
۱۴- به میزان lµ ۱۰ از RNAase به هر لوله اضافه شد.
۱۵- لوله‌ها به مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند.
۱۶- ۱۲ میلی‌لیتر اتانول مطلق سرد به هر لوله اضافه شد.
۱۷- لوله‌ها به آرامی تکان داده شدند.
۱۸- دی‌ان‌ا با بهره گرفتن از پیپت‌ پاستور خارج شد و به تیوب ۵/۱ میلی‌لیتری منتقل شد یا با سرعت rpm ٣۴۴٠ به مدت ١٠ دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شده و رسوب داده شد.
۱۹- محلول شستشوی شماره‌ی یک، جدول (۳-۵) به دی‌ان‌ا افزوده شد و در این محلول برای مدت ٢٠ دقیقه قرار داده شد.