محتوای تیوب دور ریخته شده و طی ۵-۱۵ دقیقه اجازه خشک شدن به پلیت­ها داده شد.
پلیت­ها در ۴۰ میکرو لیتر DEPC ( H₂O بدون RNase) انحلال یافتند.
بدین ترتیب RNA استخراج شده و برای سنجش میزان غلظت RNA و خلوص آن از دستگاه اسپکتروفتومتر ساخت شرکتEppendorf آلمان استفاده گردید.

۲-۲-۳ اندازه ­گیری میزان غلظت RNA و رقیق­سازی نمونه­ها
غلظت RNA با دستگاه اسپکتروفتومتر برای هر نمونه اندازه ­گیری شد. بدین نحو که ۲ میکرو لیتر از نمونه RNA در ۱۹۸ میکرولیتر آب دیونیزه حل و غلظت توسط دستگاه خوانده شد. پس از هر بار استفاده با قرار دادن سل (Cuvette) حاوی آب مقطر دستگاه صفر گردید. اعداد بدست آمده از سنجش RNA برای رقیق­سازی محلول­ها ضروری می­باشد. بدین طریق تمام محلول­ها به یک میزان رقیق می­شوند.
۲-۲-۴- روش تهیه cDNA
- قبل از انجام آزمایش محتویات کیت بخوبی تکان داده شده و مختصرا سانتریفوژ گردید.
۲- مواد مورد استفاده در آزمایش در یک تیوب مخصوص عاری از آنزیم نوکلئاز ریخته و بر روی یخ قرار داده شدند:
RNA ی الگو (Template) به میزان ۱ میکرو گرم
Oligo dT به میزان ۱ میکرو لیتر
آب DEPC نیز به مقداری که محتوی کل موجود در تیوب به مقدار ۱۲ میکرو لیتر برسد، به محتویات موجود در تیوب اضافه گردید.
اگر RNA الگو غنی از نوکلئوتید­ها­ی سیتوزین و گوانین باشد یا دارای ساختاری ثانویه باشد، آن­را بخوبی تکان داده و سپس به میزان کمی آن­را سانتریفوژ کرده و در نهایت به مدت ۵ دقیقه در دمای cº۶۵ قرار داده می­شوند.
جهت سنتز cDNA، از کیتsynthesis First strand cDNA ساخت شرکت Fermentas استفاده شد که محتوای:
۵X Reaction buffer به میزان ۴ میکرو لیتر
مهار کننده فعالیت آنزیم RNase به میزان ۱ میکرو لیتر
دزوکسی نوکلئوتید تریوز فسفات (dNTP) به میزان ۲ میکرو لیتر
آنزیم Reverse Transcriptase به میزان ۱ میکرو لیتر
تیوب­ها در دمای ۴۲ به مدت ۱ ساعت در دستگاه PCR ساخت شرکت Eppendorf آلمان قرار داده شدند تا cDNA سنتز شود. برای توالی­های غنی از GC دمای دستگاه را می توان تا cº۴۵ افزایش داد.
واکنش با حرارت دان مخلوط مورد نظر در دمای cº۷۰ به مدت ۵ دقیقه به پایان رسید.
۲-۲-۵- واکنش RT-PCR
PCR در ۲۵ میکرو لیتر محلول حاوی ۵/۱۲ میکرولیتر Mastermix، ۵/۰ میکرو مول از هر کدام از پرایمر­ها، ۱ میکرولیتر از cDNAو ۵/۱۰ میکرولیتر آب انجام پذیرفت.در این واکنش دناتوراسیون (Denaturation) ابتدایی در دمای cº۹۵ به مدت ۳ دقیقه شروع شده و با ۳۰-۲۸ چرخه (Cycle) از دوره­ های : cº۹۵ به مدت ۲۵ ثانیه، دمایannealing cº۶۰-۵۸ به مدت ۲۰ ثانیه و دمایextension cº۷۲ به مدت ۲۵ ثانیه ادامه یافت و نهایتا به مدت ۷ دقیقه در دمای cº۷۲ extension) نهایی) به پایان رسید.
۲-۲-۶ تهیه ژل الکتروفورز
بدین منظور ابتدا TBE 5X را تهیه کرده و پس از رقیق کردن آن به ۰.۵X، آگارز به آن اضافه شد.
۲-۲-۶-۱ تهیه TBE 5X
۵۴ گرم تریس باز
۵/۲۷ گرم بوریک اسید
۲۰ میلی لیتر EDTA 5/0 مولار
مقادیر بالا در ۱ لیتر آب حل شدند.
۵/۱ گرم آگارز در mlTBE 0.5 100 حل کرده و آن­را در ماکروویو قرار داده تا بخوبی مواد حل شوند.در پایان ۴ میکرو لیتر اتیدیوم بروماید را در ژل ریخته و محصولات PCR در ژل Load گردیدند. در این آزمایشات از دستگاه الکتروفورز ساخت شرکت BIO RAD با ولتاژ ۷۰ استفاده گردید و نهایتا عکس­برداری از باند­ها تحت اشعه UV توسط دستگاه Gel Logic 212 Pro Imaging System (Carestream, USA) صورت پذیرفت. شدت باندها با بهره گرفتن از نرم­افزار Image j اندازه ­گیری شد و مقادیر با ژن اکتین۲ (Actin2) مقایسه گردید.
۲-۲-۷ پرایمر­های استفاده شده در این پژوهش
جدول ۲- ۱- توالی جفت پرایمرهای مورد استفاده برای RT-PCR