پس از بسته شدن کامل ژل ، آن را درون تانک قرار می دهیم به نحوی که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند. میزان بافر TAE 1x دورن تانک الکتروفورز باید به حدی باشد که به طور کامل روی ژل را بپوشاند.
نمونه را به همراه (loading dye) در درون چاهک ریخته و از یک مارکر وزن مولکولی ۱kb هم جهت شناسایی سایز قطعات در یکی از چاهک ها استفاده می کنیم.
تانک الکتروفورز را به منبع تولید ولتاژ وصل کرده و با ولتاژ ۱۲۰ ولت و ۵۵ آمپر الکتروفورز را انجام می دهیم.
وقتی رنگ تا حد.ود ۳/۲ ژل پیشرفت کرد تانک را از منبع نیرو جدا کرده و ژل را به کمک دستگاه مورد بررسی قرار می دهیم.
۳-۵ ساب کلونینگ ژن CD166
جهت بیان ژل CD166 از باکتری E.coli BL21(DE3) استفاده شد. ابتدا ژن موردنظر از ژل اگارز مرحله الکتروفورز خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد. سپس این ترکیب به سلول های شایسته ای E.Coli BL21 ترانسفورم شد.
۳-۵-۱ تلخیص DNACD166 از ژل
برای تلخیص از کیت استخراج DNA از ژل تولیدی شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد. (شکل ۳-۹)

شکل ۳-۹٫ کیت استخراج DNA از ژل فرمنتاز
روش انجام آن بصورت زیر می باشد :
به کمک این اسکالپل استریل ، ناحیه ای از ژل که DNACD166 در آن قرار دارد را جدا کرده و به قطعات کوچک تقسیم می کنیم تا زودتر در Binding Buffer حل شود.
به ژل حاوی DNA نوترکیب ، ۴۰۰ میکرولیتر Binding Buffer در داخل یک میکروتیوب اضافه می کنیم.
مخلوط را به داخل بن ماری ۵۵ درجه انتقال داده و به مدت ۵ دقیقه انکوبه می کنیم برای سهولت در ذوب شدن کامل ژل آن را هر ۲ دقیقه هم می زنیم.
۵ میکرولیتر سیلیکا به مخلوط اضافه می کنیم.
۵ دقیقه در بن ماری ۵۵ درجه قرار می دهیم تا سیلیکا به خوبی حل شود.
به مدت ۱۰ ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده تا سیلیکا رسوب کند. محلول رویی را دور می ریزیم.
۵٫٫ میکرولیتر Washing buffer به میکروتیوب اضافه کرده و به کمک ورتکس به خوبی مخلوط می کنیم.
به مدت ۱۰ ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را دور می ریزیم.
مرحله ی ۷ و ۸ را دوبار دیگر تکرار می کنیم تا تمام الکل موجود از مرحله ی قبل حذف شود (الکل ممکن است از واکنش های آنزیمی مراحل بعدی جلوگیری کند).
۳۰ میکرولیتر بافر TE به رسوب اضافه کرده و ورتکس می کنیم تا کاملا با محتویات میکروتیوب مخلوط شود.
میکروتیوب را به مدت ۵ دقیقه در ۵۵ درجه قرار می دهیم.
به مدت ۱ دقیقه میکروتیوب را در ۱۵۰۰۰ دور سانتریفیوژ کرده تا تمامی ترکیبات جامد ته نشین شود. اینک محلول رویی حاوی DNA تلخیص شده است.
۳-۵-۲ لایگیشن
برای اتصال DNACD166 استخراج شده از ژل با پلاسمید بیانی pet-28a در آزمایشگاه از آنزیم لیگاز^[۴۹] استفاده می شود که می تواند اتصالات فسفودی استری شکسته شده را ترمیم کند. این آنزیم از فاز T4 استخراج شده است و انرژی لازم برای فعالیت خود را از ATP تامین می کند و می تواند هم انتهاهای صاف و هم چسبنده را به هم متصل کند.
روش انجام این عمل به شکل زیر است :
محتویات واکنش را بصورت زیر مخلوط می کنیم.
بافر لایگیشن ۱۰x : 3 میکرولیتر
آب استریل : ۹ میکرولیتر
DNA لیگاز T4 : 1 میکرولیتر
پلاسمید pet-28a : 2 میکرولیتر
Insert (DNACD166) : 15 میکرولیتر
حجم نهایی : ۳۰ میکرولیتر
نکته : در آخرین مرحله آنزیم DNA لیگاز T4 اضافه شود.
به کمک دستگاه ترموسایکلر میکروتیوب حاوی مخلوط واکنش را به مدت ۴ ساعت در ۱۶ درجه سانتیگراد سپس به مدت یک شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد انکوبه می کنیم.
۳-۵-۳ ترانسفورماسیون
بدین منظور از سویه E.coli BL21 که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم. این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین تشکیل کلونی می دهد.
۳-۵-۳-۱ آماده سازی سلول های شایسته
باکتری در محیط کشت فاقد کانامایسین کشت داده شد.
پس از ۲۴ ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را انتخاب کرده و به ۵ میلی لیتر محیط LB مایع بدون کانامایسین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
یک میلی لیتر از محیط فوق را به ۵ میلی لیتر محیط LB تازه تلقیح نموده و مجددا در شکیرانکوباتور قرار می دهیم. ۲ تا ۳ ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب ۵/۰ تا ۸/۰ در ۵۰۰ نانومتر را به ما می دهد.
باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و ۵ الی ۱۰ دقیقه روی یخ نگه می داریم.
میکروتیوب ها را ۳ دقیقه در ۹۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل ۱/۰ مولار کلرید کلسیم حل می کنیم.
۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم.
این بار رسوب را در ۶۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل ۱/۰ مولار حل می کنیم.