۲) به شیر بدون چربی یا ساده در دمای ۲۲۰ ، ۲۶۴ آمونیوم‌سولفات جامد اضافه می‌کنیم که با تکان دادن شدید مکانیکی در یک بازه زمانی ۴۰ دقیقه‌ای همراه است.
مخلوط را به مدت ۲ ساعت پس از افزودن آمونیوم سولفات به همین ترتیب هم می‌زنیم.
۳) بعد از گذشت ۲ ساعت هم‌زدن مداوم و افزوده شدن کل نمک آمونیوم‌سولفات، مخلوط را در درون یک ظرف شیشه‌ای به وسیله کاغذ صافی، صاف گردید.
بهتر است که از یک کاغذ صافی بزرگ (cm20) استفاده شود تا سطح بیشتری جهت صاف کردن حاصل شود.
۴) pH آب پنیر به دست آمده را (بخش۱ ()، که در حدود ۹/۶ می‌باشد) را توسط محلول HCl ۱ مولار به ۵/۳ رسانده شد (به طور تقریبی برای هر لیتر آب پنیر، mL50 از HCl ۱ مولار استفاده می‌شود).

بهتر است HCl را از یک بورت ۱۰۰ میلی‌لیتری و به آرامی زیر سطح محلول در یک بازه زمانی ۴۰ دقیقه‌ای ریخته شود.
۵) پس از نگه داشتن محلول برای ۱ ساعت، آن را در دور g13200 با دمای ۱۶ و به مدت ۴۰ دقیقه تحت سانتریفوژ قرار گرفت.
در این مرحله در صورتی که رسوب به دست آمده (a2) مورد نیاز باشد با حجمی از ۰۰۵/۰ برابر با از حجم آب پنیر اصلی مخلوط کرده و سپس محلول حاصله را با ۱ مولار به pH ۷ رسانده که می‌تواند بعد از این مرحله جهت جداسازی آلفالاکتالبومین مورد استفاده قرار گیرد.
۶) محلول به دست آمده از بخش قبل را (a3) توسط ۱ مولار به pH 6 رسانیده ( به طور تقریبی به ازای هر یک لیتر محلول، ۵۰ میلی‌لیتر محلول آمونیاک لازم است) و ۲۶۲ نمک آمونیوم‌سولفات جهت رسوب دادن BLG به محلول اضافه گردید.
۷) مخلوط حاصله را به مدت یک شبانه روز در دمای ۲۲۰ نگه‌داری شود.
۸) رسوب مرطوب مرحله قبل را جمع آوری کرده و در دور g34800 برای ۲۰ دقیقه سانتریفوژ گردد. محلول بالایی (a5) را دور ریخته و رسوب به دست آمده را با کمترین میزان بافر استات دارای pH ۲/۵ مخلوط کرده و درون کیسه دیالیز ریخته شود.
۹) محلول حاصله را در برابر بافر استات با pH ۲/۵ به مدت ۱۲ ساعت دیالیز کرده. محلول بافری را عوض نموده و دیالیز به مدت ۱۶-۱۲ ساعت دیگر ادامهداده شود. این کار باعث خارج شدن نمک و تغلیظ BLG می شود.
۱۰) در این مرحله محلول به دست آمده حاوی درصد بالایی از BLG خواهد بود.
۲-۱۰- تکنیک دیالیز
۲-۱۰-۱- آماده سازی محلول
۲-۱۰-۱-۱- محلول کربنات سدیم ۵%
۱/۵ گرم از کربنات سدیم بی‌آب ( ۱۰۵)را در ۱ لیتر آب حل گردید تا کربنات سدیم ۵% حاصل شود.
۲-۱۰-۱-۲- محلول EDTA 5%
۶/۱۴ گرم از EDTA ( ۲/۲۹۲) را در یک لیتر آب مقطر حل کرده تا محلول EDTA ۵% حاصل شود.
۲-۱۰-۲- آماده سازی کیسه‌های دیالیز
۱) کیسه‌ها در قطعات دلخواه برش زده که بستگی به حجم ماده مورد دیالیز و نوع کار دارد. در این مرحله باید دقت کرد که دست با خود کیسه‌ها تماس حاصل نکند زیرا منافذ این کیسه‌ها بسیار حساس بوده و ممکن است آسیب ببیند؛ که جهت خودداری از آسیب زدن به آن‌ها می‌توان از دستکش استفاده نمود.
۲) در این مرحله کیسه‌ها را ۳ مرتبه و هر مرتبه به مدت زمان ۱۵ دقیقه در یک لیتر محلول کربنات‌سدیم ۵% جوشانده و سپس با آب مقطر شست و شو داده شد. در زمان جوشیدن کیسه‌ها را در آب خوب به هم زده تا منافذ آماده شوند.
۳) سپس کیسه‌ها را به مدت ۱۵ دقیقه در یک لیتر محلول EDTA 5% جوشانده و پس از اتمام با آب مقطر شست و شو داده شد.
۴) تا زمان به کار بردن کیسه‌ها، آن‌ها را در اتانول ۲۰% درون یخچال در دمای ۴ نگه داری گردید.
نکته:در تمامی مراحل سعی شود که از تماس دست با کیسه‌ها جلوگیری شود
۲-۱۰-۳- نحوه انجام دیالیز
۱)یک سر کیسه دیالیز را قبل از آماده شدن گره زده و محلول مورد نظر درون کیسه دیالیز ریخته شد. سپس سر دیگر کیسه را گره زده و کیسه درون بافر قرار گرفت. البته بستن کیسه‌ها را با نخ هم می‌توان انجام داد (در صورتی که کیسه ها از الکل خارج گردیده باشد، قبل از استفاده با آب مقطر شست و شو داده می شوند).
۲) کیسه‌ها را به صورت شناور در محلول دیالیز قرار داده و در دمای پایین (نزدیک به ۴) محلول را در اطراف کیسه بسیار آرام به حرکت در آورده می‌شوند.
۳) بسته به نوع ماده هر ۳ ساعت یا چند ساعت محلول دیالیز را عوض میگردد.
۲-۱۱- استری کردن
۲-۱۱-۱- محلول‌سازی
برای استری کردن هر تعداد الکل که با آن‌ها استری کردن قرار است صورت بگیرد را تهیه می‌شود. از آنجا که جهت استری کردن نیاز به مقداری آب در محیط جهت راه‌اندازی واکنش دارد از تمامی الکل‌ها که خالص بودند، غلظت ۹۵% تهیه شد.
الکل‌های مورد استفاده در این واکنش شامل متانل، اتانل، بوتانل، ۱-پروپانل (n-پروپانل)، ایزوپروپانل، پنتانل و هگزانل می‌باشد که از تمامی آن‌ها غلظت ۹۵% تهیه گردید.
۲-۱۱-۲- نحوه استری کردن
۱) ابتدا نمونه‌های پروتئینی مورد نظر درون تیوب‌های ۵/۱ میلی‌لیتری توزین می‌‌گردد.
۲) سپس نمونه پروتئینی با غلظت‌های ۲ تا ۵% در الکل‌های ۹۵% و خنک شده نام برده در بالا حل شدند.
۳) مقادیر حساب شده اسید کلریدریک N12 به صورت قطره قطره آنقدر اضافه شد تا اینکه غلظت نهایی اسید در مخلوط حاصل شده به N ۷/۰ رسید.
۴) تمامی مخلوط به دست آمده تحت تکان خوردن شدید و مداوم در دمای ۴ درون انکوباتو شیکر یخچال‌دار ژال‌تجهیز قرار گرفت و به مدت ۲۰ ساعت نگه‌داری شد.
مدت زمان نگه‌داری این مخلوط از ۶ تا ۴۸ ساعت می‌تواند متغیر باشد، اما به طور معمول در ۲۰ ساعت واکنش کامل شده و بعد از ۴۸ ساعت ممکن است واکنش برگشت پیدا کند.
۵) پس از پایان یافتن زمان واکنش نمونه‌ها را در دور g 1000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ کرده و محلول بالایی به دست آمده را دور ریخته می‌شود. باقی مانده را در محلول خالص الکلی که مورد استفاده قرار گرفته‌است، حل کرده که دارای حجم برابر با محلول دور ریخته شده خواهد بود و قبل از اینکه دوباره ساتریفوژ انجام پذیرد خوب به هم می‌خورد.
این مرحله شست و شو ۳ مرتبه تکرار می‌شود.
۶) رسوب نهایی را در مقدار کافی آب دوبار تقطیر حل نموده و قبل از خشک کردن با خلاء در دمای ۸۰- نگه‌داری می‌شود.
۷) نمونه‌ها را پس از خشک کردن با خلاء می‌توانند در دمای ۲۰- نگه‌داری شوند.
۲-۱۱-۳- خشک کردن با خلاء
۱) دستگاه را روشن کرده تا دمایش به میزان مطلوب (معمولا ۵۰-۴۷ درجه سانتیگراد) برسد. از قبل این کار را صورت می‌پذیرد زیرا رسیدن به این دما ۱ تا ۲ ساعت زمان می‌برد.
۲) نمونه‌هایی را که قرار است با خلاء خشک شوند از قبل در یخجال ۸۰- قرار داده تا منجمد شوند. با این کار از ریخته شدن احتمالی نمونه‌ها در زمان انجام خشک کردن جلوگیری می‌شود.
برای اطمینان بیشتر می‌توان درب ظروف را با پارافیلم پوشاند و چند روزنه روی سطح آن قرار داد.
۳) نمونه‌ها را در ظرف شیشه‌ای مخصوص دستگاه قرار داده و محکم آن‌ها تثبیت می‌شوند.
۴) ظرف شیشه‌ای را به همراه درب مخصوصش به دستگاه متصل کرده و هوای درون شیشه را با چرخاندن پیچ آن خالی نموده.
۵) دستگاه را به پمپ خلاء وصل کرده و این کار را تا خشک شدن کامل نمونه انجام می‌شود.
۶) پس از پایان خشک شدن، نمونه را در ۲۰- نگه‌داری می‌شود.